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R语言中如何进行PCA分析？利用ggplot和prcomp绘制基因表达量分析图

2023-11-10

学习笔记的主要内容是在R语言中利用ggplot2进行PCA分析和绘图，包括简单分析与操作流程，对比不同方式得到的结果差异，提供脚本代码供练习.

PCA分析的原理

在处理基因差异表达数据时，有时候需要分析其中因素的影响最大，判断结果的关系，这个时候可以用PCA分析法，之前发过一篇PCA分析的简介和数学原理解析，如果有兴趣点击这里查看，今天的笔记主要围绕实际操作过程进行分享。笔者学习时参考易汉博的教程，感觉这个教程挺好的，推荐给大家，也可以在学习过程中一起交流。

PCA分析示例

创建演示数据

count <- 100 #设置变量个数为100
Ge_1a <- rnorm(count,4,0.6) #生成100个服从均值为4标准差为0.6正态分布的数字
Ge_1b <- rnorm(count,19,0.4)
gro_a <- rep('a',count) #生成100个a，代表a组
gro_b <- rep('b',count)

演示数据为Ge_1的表达量（每个基因包括两组类型的值各100个，且两个组的表达量有差异），接下来创建根据数据创建矩阵，设置样本的名称标签，添加新列R，并生成一个表格输出基因在200个样本中的表达量，每一行为一个样品，每一列为基因的表达值。

c_data <- data.frame(Ge_1=c(Ge_1a,Ge_1b),
                     Group=c(gro_a,gro_b))
label <- c(paste0(gro_a,1:count),paste0(gro_b,1:count))
row.names(c_data) <- label

c_data$R <- rep(0,count*2)
kable(headTail(c_data),booktabs=TRUE,
      caption="Expr Profile For Ge_1 in 200 samples")

生成了200行3列的表格数据，结果如下：

Table: Expr Profile For Ge_1 in 200 samples
|     |Ge_1  |Group |R   |
|:----|:-----|:-----|:---|
|a1   |4.77  |a     |0   |
|a2   |4.13  |a     |0   |
|a3   |4.15  |a     |0   |
|a4   |4.04  |a     |0   |
|...  |...   |NA    |... |
|b97  |18.93 |b     |0   |
|b98  |18.06 |b     |0   |
|b99  |18.74 |b     |0   |
|b100 |19.52 |b     |0   |

加载R包

library(knitr)
library(psych)
library(reshape2)
library(ggplot2)
library(ggbeeswarm)
library(scatterplot3d)
library(useful)
library(ggfortify)

需要加载上述R包，如果没有请先安装后载入R包。

绘制图像

p <- ggplot(c_data,aes(Ge_1,R)) + geom_quasirandom(
  aes(color=factor(Group))) +theme(legend.position = c(0.5,0.8)) +
  theme(legend.title = element_blank()) +
  scale_fill_discrete(name="Group") +
  theme(axis.line.y=element_blank(),
        axis.text.y=element_blank(),
        axis.ticks.y=element_blank(),
        axis.title.y=element_blank()) +
  ylim(-0.5,5) + xlim(0,25)
p

利用ggplot函数进行绘图，发现200个样本在Ge1基因表达量上分为了两类（原因是刚刚生成数据时分成了两个不同类型的组，表达量存在差异）

添加一个基因

刚刚是只有Ge1的情况，接下来再创建一个Ge_2（方法和刚刚类似），看看两个基因时情况会发生什么变化？
创建一组均值为6标准差为0.3的正态分布随机数据，并设置行名构建矩阵，输出表达矩阵。需要注意的是：Ge_2的表达量保持稳定（a组和b组的表达水平相当），不像Ge_1存在表达量差异。

> count <- 100
> Ge_2a <- rnorm(count,6,0.3)
> Ge_2b <- rnorm(count,6,0.3)
> c2_data <- data.frame(Ge_1=c(Ge_1a,Ge_1b),Ge_2=c(Ge_2a,Ge_2b),
+                       Group=c(gro_a,gro_b))
> row.names(c2_data) <- label
> kable(headTail(c2_data),booktabs=T,
+                caption="Expression for Ge_1 and Ge_2 in 200 samples")

Table: Expression for Ge_1 and Ge_2 in 200 samples
|     |Ge_1  |Ge_2 |Group |
|:----|:-----|:----|:-----|
|a1   |4.77  |5.71 |a     |
|a2   |4.13  |5.65 |a     |
|a3   |4.15  |6.38 |a     |
|a4   |4.04  |5.88 |a     |
|...  |...   |...  |NA    |
|b97  |18.93 |6.06 |b     |
|b98  |18.06 |6.29 |b     |
|b99  |18.74 |5.78 |b     |
|b100 |19.52 |5.87 |b     |

利用ggplot函数作图，数据为c2data，此时能显示出Ge1和Ge2的分布情况，可以看出在Ge_1(x轴)上分成了两类，而Ge_2上分类趋势很小（因为Ge_2本身就没什么差异分组）

p <- ggplot(c2_data,aes(Ge_1,Ge_2)) +
  geom_point(aes(color=factor(Group))) +
  theme(legend.position = c(0.5,0.8)) +
  theme(legend.title = element_blank()) +
  ylim(0,10)+xlim(0,25)
p

再添加一个基因

刚刚是两个基因，现在再加一个Ge_3，这个基因的表达量差异设置的更大一些，设置该基因分成两个组，而且每个组的表达量也存在两种类型，所以这个基因对样本分类的作用更大。

> count <- 100
> Ge_3a <- c(rnorm(count/2,6,0.4),rnorm(count/2,14,0.3))
> Ge_3b <- c(rnorm(count/2,14,0.3),rnorm(count/2,4,0.4))
> data_3 <- data.frame(Ge_1=c(Ge_1a,Ge_1b),
+                      Ge_2=c(Ge_2a,Ge_2b),
+                      Ge_3=c(Ge_3a,Ge_3b),
+                      Group=c(gro_a,gro_b))
> data_3 <- as.data.frame(data_3)
> data_3$Group <- as.factor(data_3$Group)
> row.names(data_3) <- label
> 
> kable(headTail(data_3),booktabs=T,caption = "Expression 3 Genes in 200 samples")


Table: Expression 3 Genes in 200 samples
|     |Ge_1  |Ge_2 |Ge_3 |Group |
|:----|:-----|:----|:----|:-----|
|a1   |4.77  |5.71 |5.61 |a     |
|a2   |4.13  |5.65 |6.38 |a     |
|a3   |4.15  |6.38 |6.47 |a     |
|a4   |4.04  |5.88 |5.82 |a     |
|...  |...   |...  |...  |NA    |
|b97  |18.93 |6.06 |3.57 |b     |
|b98  |18.06 |6.29 |4.37 |b     |
|b99  |18.74 |5.78 |4.18 |b     |
|b100 |19.52 |5.87 |4.82 |b     |

生成一组颜色变量，用于区分不同类别。每个数据向底面做垂直投影，可以看出在x轴方向（Ge_1）和z轴（Ge_3）上投影时在不同位置分成两类，而在y轴（Ge_2）上投影位于同一区域，所以可以看出Ge_2对样本分类的贡献度最小。

colorl <- c("#E19F90", "#96B4E9")
colors <- colorl[as.numeric(data_3$Group)]
scatterplot3d(data_3[,1:3],color=colors,xlim=c(0,24),
              ylim=c(0,24),zlim=c(0,24),type="h",
              angle=45,pch=16)
legend("top",legend=levels(data_3$Group),col=colorl,
       pch=16,xpd=T,horiz=T)

通过上面的演示，已经基本了解PCA的作用了，通过PCA分析能将不同基因在不同样本中的表达量分成几类，接下来，用简单的例子来演示流程。

PCA的实现流程

使用上面创建的data_3数据来进行后续操作。首先生成表达矩阵，包含3个基因在200个样本中的表达情况。

> kable(headTail(data_3),booktabs=T,caption = "Expression 3Gene in 200 samples")
Table: Expression 3Gene in 200 samples
|     |Ge_1  |Ge_2 |Ge_3 |Group |
|:----|:-----|:----|:----|:-----|
|a1   |4.77  |5.71 |5.61 |a     |
|a2   |4.13  |5.65 |6.38 |a     |
|a3   |4.15  |6.38 |6.47 |a     |
|a4   |4.04  |5.88 |5.82 |a     |
|...  |...   |...  |...  |NA    |
|b97  |18.93 |6.06 |3.57 |b     |
|b98  |18.06 |6.29 |4.37 |b     |
|b99  |18.74 |5.78 |4.18 |b     |
|b100 |19.52 |5.87 |4.82 |b     |
# 对数据进行标准化处理
> data_3_cs <- scale(data_3[,1:3],center = T,scale = T)
> kable(headTail(data_3_cs),booktabs=T,caption = "norm Expression 3 gene in 200 samples")

上面的代码是对数据进行标准化和中心化处理（使数据的差异变化幅度在同一水平），将数据转化为均值为0且标准差为1的新数据集。

Table: norm Expression 3 gene in 200 samples

|     |Ge_1  |Ge_2  |Ge_3  |
|:----|:-----|:-----|:-----|
|a1   |-0.89 |-1    |-0.87 |
|a2   |-0.98 |-1.22 |-0.7  |
|a3   |-0.97 |1.41  |-0.68 |
|a4   |-0.99 |-0.37 |-0.82 |
|...  |...   |...   |...   |
|b97  |0.99  |0.25  |-1.32 |
|b98  |0.88  |1.08  |-1.14 |
|b99  |0.97  |-0.73 |-1.18 |
|b100 |1.07  |-0.44 |-1.04 |
> data_3_cs_cov <- cov(data_3_cs)
> kable(data_3_cs_cov,booktabs=T,
+       caption = "cov for 3 gene in 200 samples")

上面的代码生成协方差矩阵，计算3个基因在200个样本中表达数据的协方差。

Table: cov for 3 gene in 200 samples

|     |       Ge_1|       Ge_2|       Ge_3|
|:----|----------:|----------:|----------:|
|Ge_1 |  1.0000000| -0.0808226| -0.1181946|
|Ge_2 | -0.0808226|  1.0000000| -0.0106916|
|Ge_3 | -0.1181946| -0.0106916|  1.0000000|
> data_3_cs_cov_e <- eigen(data_3_cs_cov)
#求解特征值和特征向量
> data_3_cs_cov_e$values #特征值
> [1] 1.1383477 1.0099558 0.8516964
> data_3_cs_cov_e$vectors #特征向量
>       [,1]        [,2]       [,3]
> [1,]  0.7189945  0.02734216 -0.6944778
> [2,] -0.3748044 -0.82622441 -0.4205650
> [3,] -0.5852936  0.56267720 -0.5838028

上面的代码得到特征值和特征变量，下面的代码用于产生新矩阵。

> pc_select <- 3
> label <- paste0("PC",c(1:pc_select))
> data_3_n <- data_3_cs %*% data_3_cs_cov_e$vectors[,1:pc_select] #%*%表示矩阵相乘
> colnames(data_3_n) <- label
> kable(headTail(data_3_n),booktabs=T,
+       caption = "PCA gene matrix for 3 gene in 200 samples")


Table: PCA gene matrix for 3 gene in 200 samples

|     |PC1   |PC2   |PC3   |
|:----|:-----|:-----|:-----|
|a1   |0.24  |0.31  |1.55  |
|a2   |0.16  |0.59  |1.6   |
|a3   |-0.83 |-1.57 |0.48  |
|a4   |-0.09 |-0.18 |1.32  |
|...  |...   |...   |...   |
|b97  |1.39  |-0.92 |-0.02 |
|b98  |0.89  |-1.51 |-0.4  |
|b99  |1.66  |-0.03 |0.33  |
|b100 |1.54  |-0.19 |0.05  |

接下来，比较两种方式对样本的聚类差异情况，设置工作区同时输出两个图，并使用scatterplot3d进行绘图。

colorl <- c("#E38F92","#97B6E1")
colors <- colorl[as.numeric(data_3$Group)]

par(mfrow=c(1,2)) #图片输出区为一行两图的布局

scatterplot3d(data_3[,1:3],color = colors,
              angle=45,pch=16,main="before data")

# 生成图例legend("top",legend = levels(data_3$Group),col=colorl,pch=16,xpd=T,horiz = T)
scatterplot3d(data_3_n,color=colors,angle = 45,pch=16,
              main="after data")


通过对比上图，可以发现两种数据处理方式形成的样品分组情况不同，在处理后数据右图中，样本的分散程度更大，笔者的理解是其变化特征显示的更广泛，相比左图能够读取更多信息，处理后效果更好（可能是因为此时变量间非线性相关）。

利用prcomp进行PCA分析

pca_data_3 <- prcomp(data_3[,1:3],center=T,scale=T)
str(pca_data_3)

上面的代码对data_3数据进行处理，得到新数据，接着查看一下pca_data_3的数据信息摘要。

List of 5
 $ sdev    : num [1:3] 1.067 1.005 0.923
 $ rotation: num [1:3, 1:3] -0.719 0.3748 0.5853 0.0273 -0.8262 ...
  ..- attr(*, "dimnames")=List of 2
  .. ..$ : chr [1:3] "Ge_1" "Ge_2" "Ge_3"
  .. ..$ : chr [1:3] "PC1" "PC2" "PC3"
 $ center  : Named num [1:3] 11.47 5.99 9.55
  ..- attr(*, "names")= chr [1:3] "Ge_1" "Ge_2" "Ge_3"
 $ scale   : Named num [1:3] 7.52 0.277 4.548
  ..- attr(*, "names")= chr [1:3] "Ge_1" "Ge_2" "Ge_3"
 $ x       : num [1:200, 1:3] -0.2399 -0.1632 0.833 0.0905 0.3406 ...
  ..- attr(*, "dimnames")=List of 2
  .. ..$ : chr [1:200] "a1" "a2" "a3" "a4" ...
  .. ..$ : chr [1:3] "PC1" "PC2" "PC3"
 - attr(*, "class")= chr "prcomp"

生成新的数据包含五个变量，按照之前的方法对其进行处理。

data_pca_n <- pca_data_3$x
kable(headTail(data_pca_n),booktabs=T,
      caption = "PCA gene matrix")

得到prcomp方式的基因表达矩阵，此时存在三个主成分（PC1、2、3）。

Table: PCA gene matrix
|     |PC1   |PC2   |PC3   |
|:----|:-----|:-----|:-----|
|a1   |-0.24 |0.31  |1.55  |
|a2   |-0.16 |0.59  |1.6   |
|a3   |0.83  |-1.57 |0.48  |
|a4   |0.09  |-0.18 |1.32  |
|...  |...   |...   |...   |
|b97  |-1.39 |-0.92 |-0.02 |
|b98  |-0.89 |-1.51 |-0.4  |
|b99  |-1.66 |-0.03 |0.33  |
|b100 |-1.54 |-0.19 |0.05  |
# 查看特征向量
> pca_data_3$rotation
            PC1         PC2        PC3
Ge_1 -0.7189945  0.02734216 -0.6944778
Ge_2  0.3748044 -0.82622441 -0.4205650
Ge_3  0.5852936  0.56267720 -0.5838028

接下来，比较两种方式实现PCA分析的结果差异，左图是手动方式，右图是利用prcomp方式，可以看出两种结果具有差异性。

scatterplot3d(data_3_n,color=colors,angle=45,pch=16,
              main="PCA by steps")
scatterplot3d(data_pca_n,color=colors,angle=45,pch=16,
              main="PCA by prcomp")

创建PCA计算函数

在R语言中自定义一个函数ct_PCA，用于计算处理PCA数据（参数设置对原始数据进行标准化和中心化）

ct_PCA <- function(data,center=T,scale=T){
  data_norm <- scale(data, center=center, scale=scale)
  data_norm_cov <- crossprod(as.matrix(data_norm)) / (nrow(data_norm)-1)
  data_eigen <- eigen(data_norm_cov)

  rotation <- data_eigen$vectors
  label <- paste0('PC', c(1:ncol(rotation)))
  colnames(rotation) <- label
  sdev <- sqrt(data_eigen$values)
  data_new <- data_norm %*% rotation
  colnames(data_new) <- label
  ct_pca <- list('rotation'=rotation, 'x'=data_new, 'sdev'=sdev)
  return(ct_pca)
}

标准化scale操作是指将数据的差异程度相对化，消除固有差异幅度的影响，从同一衡量标准下判断数据的差异性，接下来，分别演示不经过标准化处理和进行标准化处理的结果。

data_pca_noscale_step <- ct_PCA(data_3[,1:3],center=T,scale = F)
#只中心化，不标准化
data_pca_noscale_step$rotation #查看特征向量
              PC1          PC2          PC3
[1,]  0.993858995 -0.110611181 -0.003076602
[2,] -0.002918535  0.001590917 -0.999994476
[3,] -0.110615464 -0.993862483 -0.001258325
data_pca_noscale_pc <- data_pca_noscale_step$x

利用刚才生成的四种数据，生成四个不同类型的结果图：

par(mfrow=c(2,2)) #设置输出区为2行2列排版，同时输出4副图
scatterplot3d(data_3[,c(1,3,2)],color=colors,
              angle=45,pch=16,main="ori plot")
scatterplot3d(data_pca_noscale_pc,color=colors,
              angle=45,pch=16,main="PCA noscale")
scatterplot3d(data_3_cs[,c(1,3,2)],color=colors,
              angle=45,pch=16,main="ori plot(scale)")
scatterplot3d(data_3_n,color=colors,
              angle=45,pch=16,main="PCA scale")

依次生成4副图，可以看出上面两张图（没有scale标准化）的分布比较秘籍，而经过scale处理之后数据的分散程度更高（下面两张图），说明标准化处理后数据的相对变化幅度信息被保留，差异细节更清晰，这也是PCA分析的目的所在。

本文中所有代码已整理打包，下载链接：
https://down.jewin.love/?f=/Rscript/PCA.R
参考资料：http://www.ehbio.com

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