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RNA-seq流程学习笔记（4）-使用FastQC软件对fastq格式的数据进行质量控制

2023-05-16

今天开始学习使用FastQC软件对范例SRA测序文件的质量进行分析。
主要参考文章：
RNA-seq(3):sra到fastq格式转换并进行质量控制
转录组入门（3）：了解fastq测序数据
用FastQC检查二代测序原始数据的质量
FastQC Tutorial & FAQ
从零开始完整学习全基因组测序（WGS）数据分析：第2节 FASTA和FASTQ

数据质控是一个综合的评价标准，其中主要指标为碱基质量与含量分布，如果这两个指标合格，后面大部分指标都可以通过；如果这两项不合格，其余都会受到影响。
其中一些指标并不适合所有数据，例如DNA测序数据与RNA测序数据之间的差异等，要根据具体数据类型具体分析。

FASTA的介绍
我们接触到的序列信息有FASTA和FASTQ两种格式，这是存储核苷酸序列信息（DNA序列）或者蛋白质序列信息最常使用的两种纯文本文件。
FASTA存的都是已经排列好的序列（如参考序列），起源于一款“FASTA”的比对软件，之后便以FASTA作为这种存储有顺序的序列数据的文件后缀，文件后缀除了.fasta之外，也常用.fa或者.fa.gz（gz压缩），包括常用的参考基因组序列、蛋白质序列、编码DNA序列（coding DNA sequence，简称CDS）、转录本序列等文件。
FASTA文件主要由两个部分构成：序列头信息（有时包括一些其它的描述信息）和具体的序列数据。序列头信息独占一行，以大于号（>）开头作为识别标记，其中除了记录该条序列的名字之外，有时候还会接上其它的信息。紧接的下一行是具体的序列内容，直到另一行碰到另一个大于号（>）开头的新序列或者文件末尾。

>gene_00284728 length=231;type=dna
GAGAACTGATTCTGTTACCGCAGGGCATTCGGATGTGCTAAGGTAGTAATCCATTATAAGTAACATG
CGCGGAATATCCGGGAGGTCATAGTCGTAATGCATAATTATTCCCTCCCTCAGAAGGACTCCCTTGC
GAGACGCCAATACCAAAGACTTTCGTAAGCTGGAACGATTGGACGGCCCAACCGGGGGGAGTCGGCT
ATACGTCTGATTGCTACGCCTGGACTTCTCTT

FASTQ的介绍
FASTQ存的则是产生自测序仪的原始测序数据，它由测序的图像数据转换过来，也是文本文件，文件大小依照不同的测序量（或测序深度）而有很大差异，小的可能只有几M，大的则常常有几十G上百G，文件后缀通常都是.fastq，.fq或者.fq.gz（gz压缩）。
FASTQ有独特的格式：每四行成为一个独立的单元，我们称之为read。具体的格式描述如下：
第一行：以‘@’开头，是这一条read的名字，这个字符串是根据测序时的状态信息转换过来的，中间不会有空格，它是 每一条read的唯一标识符，同一份FASTQ文件中不会重复出现，甚至不同的FASTQ文件里也不会有重复；
第二行：测序read的序列，由A，C，G，T和N这五种字母构成，这也是我们真正关心的DNA序列，N代表的是测序时那些无法被识别出来的碱基；
第三行：以‘+’开头，在旧版的FASTQ文件中会直接重复第一行的信息，但现在一般什么也不加（节省存储空间）；
第四行：测序read的质量值，这个和第二行的碱基信息一样重要，它描述的是每个测序碱基的可靠程度，用ASCII码表示。

@DJB775P1:248:D0MDGACXX:7:1202:12362:49613
TGCTTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
+
JJJJJIIJJJJJJHIHHHGHFFFFFFCEEEEEDBD?DDDDDDBDDDABDDCA
@DJB775P1:248:D0MDGACXX:7:1202:12782:49716
CTCTGCGTTGATACCACTGCTTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTAGATCGG
+
IIIIIIIIIIIIIIIHHHHHHFFFFFFEECCCCBCECCCCCCCCCCCCCCCC

FastQC的介绍
FastQC aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing pipelines. It provides a modular set of analyses which you can use to give a quick impression of whether your data has any problems of which you should be aware before doing any further analysis.
The main functions of FastQC are：

  • Import of data from BAM, SAM or FastQ files (any variant)
  • Providing a quick overview to tell you in which areas there may be
    problems
  • Summary graphs and tables to quickly assess your data
  • Export of results to an HTML based permanent report
  • Offline operation to allow automated generation of reports without running the interactive application

1. 首先进入待分析数据的目录中，查看需要分析的SRA名称：

xiaomotong@VirtualBox: cd ~/Public/SRA/sra
xiaomotong@VirtualBox:~/Public/SRA/sra$ ll
总用量 2262608
drwxrwxr-x 2 xiaomotong xiaomotong       4096 5月  17 15:04 ./
drwxrwxr-x 8 xiaomotong xiaomotong       4096 5月  14 15:40 ../
-rw-rw-r-- 1 xiaomotong xiaomotong 1057984832 5月  14 12:02 SRR390728_1.fastq
-rw-rw-r-- 1 xiaomotong xiaomotong 1057984832 5月  14 12:02 SRR390728_2.fastq
-rw-rw-r-- 1 xiaomotong xiaomotong  195044834 5月  14 11:40 SRR390728.sra
-rw-rw-r-- 1 xiaomotong xiaomotong    5867015 5月  14 11:40 SRR390728.sra.vdbcache

2. 使用fastqc命令对目标数据进行分析：

xiaomotong@VirtualBox:~/Public/SRA/sra$ fastqc -t 3 ./SRR390728_1.fastq
Started analysis of SRR390728_1.fastq
Approx 5% complete for SRR390728_1.fastq
。。。。。。
Approx 95% complete for SRR390728_1.fastq
Analysis complete for SRR390728_1.fastq

fastqc 命令的用法

fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] seqfile1 .. seqfileN

#参数：
-o --outdir 输出目录，需自己创建目录
–(no)extract 是否解压输出文件，默认是自动解压缩zip文件。加上–noextract不解压文件。
-f 指定输入文件的类型，支持fastq|bam|sam三种格式的文件，默认自动识别。
-t --threads选择程序运行的线程数，即同时处理的文件数目。
-c --contaminants，污染物选项，输入的是一个文件，格式是Name [Tab] Sequence，里面是可能的污染序列，如果有这个选项，FastQC会在计算时候评估污染的情况，并在统计的时候进行分析，一般用不到。

fastqc -o .  *.fastq.gz
#将所有的数据进行质控，得到zip的压缩文件和html文件
# -o后面有空格，表示输出到当前文件夹，之后的.后也有空格

3. 质控结果解读
处理后产生.html和fastqc.zip两个文件，如下：

xiaomotong@VirtualBox:~/Public/SRA/sra$ ll
总用量 2264264
drwxrwxr-x 2 xiaomotong xiaomotong       4096 5月  19 15:21 ./
drwxrwxr-x 8 xiaomotong xiaomotong       4096 5月  14 15:40 ../
-rw-rw-r-- 1 xiaomotong xiaomotong 1057984832 5月  14 12:02 SRR390728_1.fastq
-rw-rw-r-- 1 xiaomotong xiaomotong     526256 5月  19 15:20 SRR390728_1_fastqc.html
-rw-rw-r-- 1 xiaomotong xiaomotong     316413 5月  19 15:20 SRR390728_1_fastqc.zip

报告保存在.html文件中，可以调用Linux系统上的firefox命令来打开(参考文章)

xiaomotong@VirtualBox:~/Public/SRA/sra$ firefox ./SRR390728_1_fastqc.html

3.1. FastQC报告概览
**Basic Statistics**

  • 左边是目录概要，可以点击想要看的结果，右边会跳转到特定详细的可视化结果。绿色代表“通过”，黄色代表“警告”，红色代表“不通过，失败”。
  • 右边是Basic Statistics，基本的数据统计包括文件名，文件类型，编码形式，总的序列数，质量差的序列，序列平均长度，GC含量。

3.2. 每个位置的碱基测序质量
在这里插入图片描述

  • Per base sequence quality，每个read各位置碱基的测序质量。横轴是碱基的位置，纵轴是质量分数，Quality
    score=-10log10p（p代表错误率），所以当质量分数为40的时候，p就是0.0001，质量算高了。红色线代表中位数，蓝色线代表平均数，黄色线是25%-75%区间，触须是10%-90%区间（黄色和触须我不是特别明白）。若任一位置的下四分位数低于10或者中位数低于25，出现“警告”；若任一位置的下四分位数低于5或者中位数低于20，出现“失败，Fail”。通常认为从第二个碱基开始，平均每个碱基的测序质量boxplot下四分位线在30分以上，则认为测序质量非常好。

3.3. 每条序列的测序质量分数
在这里插入图片描述

  • Per sequence quality scores，reads质量的分布，当峰值小于27时，警告；当峰值小于20时，fail。
  • 一般认为，90%的reads测序质量在35分以上，则认为该测序质量非常好。

3.4. ATGC碱基在各个位置上的分布
在这里插入图片描述

  • Per base sequence content，对所有reads的每一个位置，统计ATCG四种碱基的分布，横轴为位置，纵轴为碱基含量，正常情况下每个位置每种碱基出现的概率是相近的，四条线应该平行且相近。当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。本结果前10个位置，每种碱基频率有略微的差别，说明可能有污染。当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报"WARN"；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报"FAIL"。
  • 一般来说，AT含量高于CG含量，AT含量约28%，CG含量约22%。由于测序问题，通常第一二位置的碱基测序质量比较低，ATCG含量也不正常。这种情况不影响数据质量，如果实在介意，可在后续bowtie mapping的时候将前两个碱基去掉。

3.5. GC碱基在各个位置上的分布
在这里插入图片描述

  • Per Sequence GC Content，统计reads的平均GC含量的分布。红线是实际情况，蓝线是理论分布（正态分布，均值不一定在50%，而是由平均GC含量推断的）。曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。偏离理论分布的reads超过15%时，报"WARN"；偏离理论分布的reads超过30%时，报"FAIL"。

3.6. N碱基（无法识别的碱基）在各个位置上的分布
在这里插入图片描述

  • Per base N content，当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”，统计N的比率。正常情况下，N值非常小,所以图上常常看到一条直线，但放大Y轴之后会发现还是有N的存在，这不算问题。当Y轴在0%-100%的范围内也能看到“鼓包”时，说明测序系统出了问题。当任意位置的N的比例超过5%，报"WARN"；当任意位置的N的比例超过20%，报"FAIL"。

3.7. reads长度分布
在这里插入图片描述

  • Sequence Length Distribution，reads长度分布，当reads长度不一致时报"WARN"；当有长度为0的read时报“FAIL”。

3.8. 序列不同拷贝数的水平
在这里插入图片描述

  • Sequence Duplication Levels，统计不同拷贝数的reads的频率。测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias的存在。****横坐标是duplication的次数，纵坐标是duplicated reads的数目，以unique reads的总数作为100%。如果原始数据很大（事实往往如此），做这样的统计将非常慢，所以fastqc中用fq数据的前200,000条reads统计其在全部数据中的重复情况。如果重复数目大于等于10的reads被合并统计，我们会看到最右侧略有上扬。当非unique的reads占总数的比例大于20%时，报"WARN"；当非unique的reads占总数的比例大于50%时，报"FAIL“。

3.9. 一条序列的重复数（此条选取参考文章中数据）
在这里插入图片描述

  • Overrepresented sequences，一条序列的重复数，因为一个转录组中有非常多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。这个模块列出来大于全部转录组1%的reads序列，但是因为用的是前200,000条，所以其实参考意义不大，完全可以忽略。
  • 如果有某个序列大量出现，就叫做over-represented。fastqc的标准是占全部reads的0.1%以上。和上面的duplicate analysis一样，为了计算方便，只取了fq数据的前200,000条reads进行统计，所以有可能over-represented reads不在里面。而且大于75bp的reads也是只取50bp。如果命令行中加入了-c contaminant file，出现的over-represented sequence会从contaminant_file里面找匹配的hit（至少20bp且最多一个mismatch），可以给我们一些线索。

3.10. 接头含量
在这里插入图片描述

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