1 双波长分光光度法的原理
双波长分光光度法是在传统分光光度法的基础上发展起来的,它的理论基础是差吸光度和等吸收波长.它与传统分光光度法的不同之处,在于它采用了两个不同的波长即测量波长（又叫主波长λp,Primary Wavelength）和参比波长（又叫次波长λs,Second Wavelength）同时测定一个样品溶液[1,2],以克服单波长测定的缺点,提高了测定结果的精密度和准确度.
早期的双波长分光光度计在测定时,两束不同波长的单色光经斩光器（Chopper,一种用于双波长分光光度计中使光束按一定周期反射,遮断或通过的装置）处理后,以一定的时间间隔交替照射[1]比色杯,经待测溶液吸收后,再照到光电管上,产生两个不同的吸光度,再将这两个吸光度相减,就得到了差吸光度ΔA.根据Lamber—Beer定律,
得：
Aλ p=ελpLC+Ap (1)
A λs=ελsLC+As (2)
式中 Aλ p 、 A λs—分别为待测溶液在主波长和次波长处的吸光度,ελp 、 ελs—分别为待测溶液在主波长和次波长处的摩尔吸光系数
L—光径
C—待测溶液的浓度
Ap 、As—分别为待测溶液在主波长和次波长处的散射或背景吸收
当λp 、λs相差不太大时,由同一待测溶液产生的光散射吸光度和背景吸光度大致相等,即Ap＝A s,将（1）式－（2）式得：
Aλ p－A λs＝ΔA＝（ελp－ελs）LC （3）
对于同一待测溶液来说,ελp－ελs是一常数K,在光径L不变的情况下,（3）式可简化为：
ΔA＝KC （4）
（4）式说明,待测溶液在λp与λs两个波长处测定的差吸光度ΔA与试样中待测物质的浓度C成正比.这就是双波长法赖以建立的定量公式〔1,3〕.
双波长差吸光度法具有可以克服溶液浑浊的影响、共存组分吸收谱线叠加的干扰,以及减少比色杯的光学不均一等优点.它的差吸光度在2.5以内时,线性范围良好.
双波长分光光度法的基本原理及应用 - 百度文库
双波长分光光度法是在单位时间内有两条波长不同的单色光以一定的频率交替照射同一吸收池的溶液，然后经过检测器和电子控制系统，计算出这两个波长下吸收度的差值△A，与被测定物质的浓度成正比，这个方法称双波长分光光度法。
双波长分光光度法的关键是正确选择两波长，要求被测组分合适。在两波长处的QA足够大，而干扰组分G和背景在两波长应有相同的吸光度(DA =0)。为满足上述要求，一般是将a2选在待测组分的最大吸收波长，入:是选在干扰组分等吸收波长。此法可测定浑浊样品，也可测定吸收光谱相互重叠的混合物样品，也是当杂质使主峰产生肩峰时测定主峰物质的较好定量方法。
双波长分光光度法在对共存组分不分离定量测定时操作简便，测定结果准确，在普通分光光度计上均可进行测定。
