QIIME2学习

QIIME2分析之单端数据的导入与Deblur

前言

当fastq数据质量信息不完整/单一时，无法使用DADA2降噪——DADA2的算法不允许质量是一个值的，DADA2去重复直接是基于自己的数据本身，所以对质量要求严格
而这种数据可以用 Deblur 运行—— Deblur 算法不一样，Deblur 去重复的时候会参考数据库，但对数据库的完整度要求就比较高了，不然可能舍弃掉比较多的序列

为了使用质量信息有问题的fastq数据（前提是数据已经质控过，只是在NCBI上下载的数据质量信息有问题），我们使用 Delbur 替代 DADA2 降噪

一、导入数据

qiime tools import \
  --type 'SampleData[SequencesWithQuality]' \
  --input-path config.txt \
  --output-path  mjsample.qza \
  --input-format SingleEndFastqManifestPhred33V2

查看文件的原始数据的序列数等信息

qiime demux summarize \
  --i-data mjsample.qza \
  --o-visualization mjsample.qzv

导出qzv文件查看

qiime tools export --input-path mjsample.qzv --output-path mjsample_statistic

二、Deblur

1.按测序碱基质量过滤序列

time qiime quality-filter q-score \
  --i-demux mjsample.qza \
  --o-filtered-sequences demux-filtered.qza \
  --o-filter-stats demux-filter-stats.qza

输出结果文件:
demux-filtered.qza: 序列质量过滤后结果;
demux-filter-stats.qza: 序列质量过滤后结果统计。
48条序列用时5分多

2.去噪16S过程

deblur去噪16S过程，输入文件为质控后的序列，设置截取长度参数，生成结果文件有代表序列、特征表、样本统计。

time qiime deblur denoise-16S \
--i-demultiplexed-seqs demux-filtered.qza \
--p-trim-length 300 \
--o-representative-sequences rep-seqs-deblur.qza \
--o-table deblur-table.qza \
--p-sample-stats \
--o-stats deblur-stats.qza

输出结果文件:
deblur-table.qza 特征序列丰度表
rep-seqs-deblur.qza 特征序列文件
deblur-stats.qza 质控、去噪、去嵌合体后剩下的序列文件#查看每个样品剩余有效序列数（丰度表）—统计的文件
此处时间长，48条序列用时37分钟

3.输出文件可视化

质控、去噪、去嵌合体的统计结果#打开deblur-stats里的index.html查看

time qiime metadata tabulate \
  --m-input-file demux-filter-stats.qza \
  --o-visualization demux-filter-stats.qzv

time qiime deblur visualize-stats \
  --i-deblur-stats deblur-stats.qza \
  --o-visualization deblur-stats.qzv

qiime tools export --input-path deblur-stats.qzv --output-path deblur-stats

qiime tools export --input-path demux-filter-stats.qzv --output-path demux-filter-stats

质控、去噪、去嵌合体的统计结果#打开deblur-stats里的index.html查看

其他表格结果查看

质控、去噪、去嵌合体的统计结果#打开deblur-stats里的index.html查看

time qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data rep-seqs-deblur.qza \
  --o-visualization rep-seqs-deblur.qzv

time qiime feature-table summarize \
  --i-table deblur-table.qza \
  --o-visualization deblur-table.qzv \
  --m-sample-metadata-file sample.tsv

time qiime tools export --input-path deblur-table.qzv --output-path deblur-table_stat

导出特征序列文件

qiime tools export --input-path rep-seqs-deblur.qza --output-path rep-seqs-deblur

导出txt格式的丰度表

qiime tools export --input-path deblur-table.qza --output-path deblur-table

biom convert -i deblur-table/feature-table.biom -o asv_deblur-table.txt  --table-type "OTU table" --to-tsv

4.结果解读

deblur-table_stat中的sample-frequency-detail.html
框住的一列代表测序深度
多样性时 一般选取最小的；最小值格外小，则去除最小值选最小的

补充说明

如果使用deblur-16S，deblur执行初始的正向过滤步骤，其中它丢弃与85% GreenGenes 数据库中OTU的序列小于60%相似性的任何序列。如果不想执行此步骤，请使用deblur-other方法。

deblur目前只能对单端序列进行去噪。如果提供末合并的双端序列为输入，将对反向序列不作任何操作。请注意，deblur接受合并的序列，并将它们视为单端序列，因此如果使用deblur进行去噪，需要先合并读取。

qiime deblur COMMANDS

Usage: qiime deblur [OPTIONS] COMMAND [ARGS]...

Description: This QIIME 2 plugin wraps the Deblur software for performing
sequence quality control.

Plugin website: https://github.com/biocore/deblur
Getting user support: Please post to the QIIME 2 forum for help with this
plugin: https://forum.qiime2.org

Commands:
denoise-16S：      ​
Deblur sequences using a 16S positive filter.
​denoise-other ：   
Deblur sequences using a user-specified positive filter.
​visualize-stats ：